尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶法定量钙调素
NAD激酶是目前已知的唯一能催化NAD磷酸化生成NADP的酶，是高等植物中重要的调节蛋白之一。钙调素为其生理激活剂。根据这两种蛋白质在DEAE纤维素阴离子交换柱中被吸附能力不同，将其分离，然后收集。提取不含CaM的NADase供试。CaM依赖性NAD激酶的活性依赖于活性CaM，两者之间成定量关系，因此可用该酶定量CaM。其灵敏度高，专一性强，不受磷脂和脂肪酸的影响。
1.仪器设备
高速冷冻离心机、组织捣碎机、酸度计、恒温水浴、紫外分光光度计、台式离心机、定量加样器等。
2.操作方法
1）NAD激酶的分离、提取：取豌豆种子在自然光下25～30℃水培11～12d。提取过程在0～4℃下进行。取新鲜豌豆幼苗叶片75g，置冰箱中冷冻0.5h后，加入3倍体积缓冲液Ⅰ（含25mmol/LTris-HCl，0.5%PVP，w/v，pH8.0），并加入适量蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF8.7mg/L），用高速组织捣碎机充分捣碎（r/min，40s/次，3～5次），匀浆用4层纱布过滤后，以×g离心30min，取上清液缓慢加固体硫铵，轻搅至50%饱和度（31.3g/ml）后，于4C冰箱中静置30min，再以×g离心30min，取沉淀重溶于20ml缓冲液Ⅱ（含20mmol/LTris-HCl，1mmol/LEGTA，pH8.0）中，搅拌均匀，对0.1mol/LNaCl透析，置于4℃冰箱中过夜。
用10%BaCl2检测透析液至无白色沉淀后，再以×g离心20min，上清液即为NADase粗酶液。将粗酶液通过用缓冲液Ⅲ（含20mmol/LTris-HCl，0.1mmol/LEG-TA，pH8.0）平衡好的DEAE-纤维素柱（1.5×18cm），同时收集，然后用缓冲液Ⅲ洗脱。在波长nm处测蛋白含量，并收集含蛋白管，分别测定NADase活性。
2）NADase活力测定
（1）NADase活力测定：豌豆NADase活力测定分两步进行。
步骤I：NADase催化NAD磷酸化生成NADP（反应I）
紫外分光光度计自动或手动记录在nm处的OD值变化，计时3min，以降低的OD值大小（即OD/min·ml）表示酶活力。
（2）NADase活力测定过程：按下列配制反应液
步骤I：首先配制反应液Ⅰ
共4ml，取干净试管并编号。各试管加不同管NADase提取液各0.1ml，活性CaM12μl混匀后于37℃恒温水浴中保温5min，然后加入同时保温过的反应液I0.38ml。混匀，在37℃恒温水浴中保温30min后立即置沸水浴中15min将酶灭活。以台式离心机离心得上清液，内含第一步反应产物NADP。同时测定各NADaee提取管的基础活性（不加CaM时的活性）是否为零。
步骤Ⅱ：首先配制反应液Ⅱ
共9ml，分装6支比色杯，按步骤I得到NADP生成液0.1ml，混匀，3min后加0.1ml6-p-G脱氢酶启动反应，混匀后立即在nm处读数记录OD值变化（3min），选出具有酶活力的NADase提取管备用。
3）钙调素的定量测定
（1）钙调素样品的制备：取植物材料若干，冷冻30min后，加两倍体积的捣碎介质（含50mmol/LTris-HCl,2mmol/LEGTA,0.15mol/LNaCl,0.5mmol/LPMSF,20mmol/LNaHSO3，pH8.0）高速捣碎，用4层纱布过滤，×g冷冻离心30min，弃去沉淀，上清液以热煮处理，必须在3min内达到85～95℃，维持2～3min后迅速冷却到10℃以下，以×g离心30min。取上清液待测。
（2）CaM标准液的配制：用2ml离心管将标准含量CaM稀释成0μg/20μl，0.μg/20μl，0.μg/20μl，0.μg/20μl，0.01μg/20μl，0.05μg/20μl，0.1μg/20μl，0.5μg/20μl，1μg/20μl，2μg/20μl等系列浓度液备用。
（3）标准曲线的制作：取无基础活性的、能被CaM激活的NADase提取液，加入20μl不同浓度的CaM，测其被激活后的活性大小，用平行样品的活性平均值绘制标准曲线。
（4）样品的测定：做标准曲线的同时取20μl待测CaM样品测其激活NADase的活性值。若样品浓度太高，需稀释后测定。然后，由标准曲线上找出此活性值对应的CaM含量。再根据样品中蛋白质总量计算出CaM浓度值（μgCaM/mg蛋白质）。
3.注意事项
1）苗培养时间一般不应超过12d，苗叶在似张非张时取材，尽量取上部幼叶为宜。
2）由于NADase在常温下不稳定，故整个提取过程应在0～4℃条件下尽可能快的进行，收集到的酶不宜分装，测活后立即存入-30℃冰箱中保存。
3）DEAE-纤维素柱的平衡对提取至关重要，洗脱时流速要慢。
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